UJIAN AKHIR SEMESTER

MATA KULIAH       : KIMIA BAHAN ALAM

SKS                             : 2

DOSEN                      : Dr. Syamsurizal, M.Si

WAKTU                     : 22-29 Desember 2012

PETUNJUK : Ujian ini open book. Tapi tidak diizinkan mencontek, bilamana ditemukan, maka anda dinyatakan GAGAL. Jawaban anda diposting di bolg masing-masing.

1.      Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak.

Jawaban :

Terpenoid merupakan bentuk senyawa dengan keragaman struktur yang besar dalam produk alami yang diturunkan dan unit isoprena (C5) yang bergandengan dalam model kepala ke ekor (head-to-tail), sedangkan unit isoprena diturunkan dari metabolisme asam asetat oleh jalur asam mevalonat.

Triterpenoid : diturunkan dari isoprenoid asiklik skualen (C30H50),

Biosintesa dari terpenoid (triterpenoid) terjadi dalam 3 reaksi, yaitu:

1.      Pembentukan isoprene aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat.

2.      Penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprene akan membentuk mono-, seskui-, di-. sester, dan poli-terpenoid.

3.      Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid.

-          Pembentukan isoprene aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat. Mekanisme pembentukannya melalui jalur asam mevalonat :
As. Asetat teraktifasi oleh koenzim-A membentuk asetil koenzim-A, selanjutnya melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan asam asetoasetil koenzim-A
Asetoasetil koenzim-A mengalami kondensasi lg dg asetil koenzim-A menghasilkan senyawa mevalonil koenzim-A selanjutnya mengalami reduksi menjadi asam mevalonat

-          Penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprene akan membentuk mono-, seskui-, di. sester-, dan poli-terpenoid. Reaksi selanjutnya adalah fosforilasi, eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan IPP yg berisomerisasi menjadi DMAPP oleh enzim isomerase.  Isomerisasi IPP ke 3,3 dimethyl allyl pyrophosphate kemudian kondensasi kepala dan ekor. IPP dan DMAPP sbg unit isopren aktif berkondensasi melalui interaksi kepala ke ekor yang merupakan polimerisasi isopren untuk menghasilkan terpenoid. Biogenetik terpenoid berasal dari isopentenyl-pyrophosphate (IPP) terdiri dari lima atom karbon sebagai batu bata (building block) via jalur asam mevalonat (MVA). Isomer IPP adalah DMAPP (dimethyl allyl pyrophosphate). Kedua molekul tsb bergabung menjadi geranyl-pyrophosphate (GPP), farnesylpyrophosphate (FPP), dan gerany-lgeranyl pyrophosphate (GGPP). 

-          Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid. Triterpenoid dibiosintesis dari 6 unit isopren, dan tersusun atas C30 asiklik yang merupakan prekursor dari squalen.Triterpenoida (C30) dan tetraterpenoida (C40) berasal dari dimerisasi C15 atau C20. Yang banyak diketahui ialah dimerisasi FPP menjadi skualena yang merupakan triterpenoida dasar dan sumber dari triterpenoida lainnya dan steroida. Siklisasi dari skualena menghasilkan tetrasiklis triterpenoida lanosterol. lalu lanosterol akan melepaskan tiga gugus metil nya sehingga membentuk kolesterol. 

Identifikasi faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak yaitu :   Penggabungan ekor dan kepala C-15 atau C-20 sehingga menghasilkan triterpenoid dan senyawa lainnya dengan adanya serangan electron yang kuat.

2.       Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda.

Jawaban :

 Spektrofotometri inframerah lebih banyak digunakan untuk identifikasi suatu senyawa melalui gugus fungsinya. Untuk keperluan elusidasi struktur, daerah dengan bilangan gelombang 1400 – 4000 cm^-1 yang berada dibagian kiri spektrum IR, merupakan daerah yang khusus berguna untuk identifikasi gugus-gugus fungsional, yang merupakan absorbsi dari vibrasi ulur. Untuk menganalisis senyawa dengan spektrum IR ini, dilakukan dengan mengidentifikai gugus-gugus fungsi utama yang ditunjukkan seperti C=O, O-H, N-H, C-O, C=C, C=N, C=C dan NO. Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) memberikan gambaran mengenai jenis atom, jumlah, maupun lingkungan atom hidrogen (1H NMR) maupun karbon (13C NMR). Biasanya dilakukan spektroskopi NMR terlebih dahulu untuk mengetahui struktur atau rumus bangun suatu senyawa.

Contoh :

Flavonoid dari Buah Tumbuhan Mempelas

Spektrum IR memberikan informasi adanya pita serapan pada bilangan gelombang 1659 sampai 1580 cm−1 yang menunjukkan adanya gugus C=C aromatic dan munculnya serapan 3065 cm−1 menunjukkan adanya gugus C-H aromatik. Pita serapan pada bilangan gelombang 1738 cm−1 menunjukkan adanya gugus karbonil. Adanya gugus C-O-C ditunjukkan oleh serapan pada bilangan gelombang 1078 cm−1. Pita serapan pada bilangan gelombang 2926- 2855 cm−1 menunjukkan adanya regang C-H alifatik. Hal ini mengindikasikan adanya rantai alifatik, dimana  rantai alifatik ini berasal dari senyawa pengotor.

Spektrum Massa senyawa hasil isolasi

Sinyal-sinyal 13C-NMR ester asam lemak ini yang muncul pada daerah C-H alifatik yaitu pada daerah 11,1662 sampai 38,8941 ppm sehingga tidak mempengaruhi sinyal 13C-NMR senyawa flavonoid yang umumnya muncul pada daerah C-H aromatik yaitu pada 62,2248 - 182,6558 ppm. Spektrum massa untuk puncak dengan waktu retensi 20,377 menit memperlihatkan adanya puncak ion (M+1) pada m/z 285. Pecahan cincin A dan B pada senyawa flavon menghasilkan A1 m/z 182 dan B1 m/z 102. Hilangnya −CH3 (massa 15) sehingga menghasilkan m/z 167 dari puncak m/z 182 mengindikasikan adanya pola oksigenasi −CH3 pada senyawa flavon. Selain itu, muncul puncak dasar m/z 139 yang terbentuk dengan hilangnya molekul C=O (massa 28) dari puncak m/z 167. Hal ini lebih memperkuat dugaan bahwa terdapat gugus metoksi pada C8. 

Pergeseran kimia atom C senyawa isolat pada spektrum 13C-NMR

Berdasarkan perbandingan geseran kimia 13C-NMR antara wogonin dan senyawa hasil pemisahan, didapat bahwa geseran kimia antara keduanya hampir sama. Perbedaan yang ada tidak terlalu signifikan, sehingga dapat disimpulkan bahwa struktur senyawa hasil isolasi adalah 5-7-dihidroksi-8-metoksiflavon.

Flavonoid Kuersetin 

dari spektorkopi NMR diketahui bahwa senyawa tersebut mengandung 15 atom C dengan rumus C15H10O7. Selanjutnya dari spketrum IR:

Dari spektrum tersebut, diketahui bahwa senyawa mengandung gugus hidroksil, C-H alifatik, C=C serta dua buah H yang bertetangga dalam cincin aromatik dari daerah serapan yang ditunjukkan.

Strukturnya :

3.      Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid.

Jawaban :

Isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Kebanyakan alkaloid bersifat basa. Sifat tersebut tergantung pada adanya pasangan elektron pada nitrogen, alkaloida yang terdapat dalam suatu bakal sebagai bentuk garam, dibebaskan dari ikatan garam tersebut menjadi alkaloida yang bebas. Untuk itu ditambahkan basa lain yang lebih kuat daripada basa alkaloida tadi. Dan Penambahan asam agar mengikat garamnya dan tidak menguap.

Contoh:

Isolasi Nikotin

Dipotong-potong 10 gram daun tembakau kering atau tembakau daricerutu. Masukkan ke dalam gelas kimia 400 ml. Ditambahkan 100 ml larutan NaOH 5%. Aduk menggunakan batang pengaduk selama 20 menit. Campuran dalam gelas kimia disaring dengan menggunakan corongBuchner tanpa kertas saring. Ditekan daun tembakau dalam corong Buchner menggunakan bagian bawah gelas kimia. Daun tembakau dikembalikan ke dalam gelas kimia, ditambahkan 30 mlair, diaduk. Disaring menggunakan corong Buchner. Untk menghilangkan partikel (daun tembakau) dalam hasil saringan(filtrate), filtrate disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberiglasswool. Filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah, ditambahkan 30 mldiklorometan, dikocok. Tutup corong pisah dibuka setiap kali selesaimengocok. Dipisahkan lapisan diklorometan ke dalam labu Erlenmeyer.Ditambahkan lagi 30 ml diklorometan ke dalam sisa cairan (lapisan air) kedalam corong pisah, dikocok. Dipisahkan lapisan diklorometan. Langkahekstraksi ini dilakukan sampai semua nikotin terekstrak ke dalamdiklorometan. Dikumpulkan semua lapisan diklorometan. Ekstraksi ini dapat juga dilakukan menggunakan eter. Diuapkan diklorometan menggunakan rotary vacuum evaporator.Penguapan diklorometan atau eter dilakukan menggunakan teknik  penguapan dengan pengurangan tekanan dan jangan menggunakan api.Penguapan diklorometan atau eter dapat pula menggunakan teknik denganset alat. Ditambah 1 ml air suling ke dalam sisa penguapan, aduk perlahan-lahan,ditambahkan 4 ml methanol, disaring dengan menggunakan corong gelasyang diberi glass wool. Dituangkan 5 ml methanol ke atas glasswool untuk mencuci glasswool -nya. Disatukan kedua larutan methanol. Ditambahkan 10 ml larutan jenuh asam pikrat dalam methanol. Disaring nikotin dipikrat padat menggunakan corong Buchner (digunakan kertas saring). Dimurnikan nikotin, dipikrat ; dengan rekristalisasi.

Isolasi Kafein

Daun teh kering sebanyak 10 gram dan 10 gram Na₂CO₃dimasukkan ke labu elenmeyer 250 ml. Kemudian ditambahkan 100 ml air mendidih dan didiamkan sebentar. Setelah itu, didekantasi ke labu lain dan kemudian ditambahkan air secukupnya pada daun teh yang telah disaring. Kemudian hasil didekantasi lagi dan digabungkan dengan yang pertama. Hasil ekstrak daun teh dimasukkan ke dalam corong pisah dan dicampur dengan 30 ml diklorometana. Corong pisah digoyang-goyangkan (tapi jangan terlalu kencang) sekitar lima menit, sambil sesekali keran pada corong pisah dibuka perlahan, agar gas yang berada dalam corong keluar. Setelah terpisah, ekstrak diklorometana yang berwarna bening dituang ke labu beserta emulsinya. CaCl₂ anhidrat ditambahkan ke dalam labu. Lalu diaduk selama sepuluh menit. Setelah air menggumpal, ekstrak diklorometana didekantasi. Kemudian hasil dekantasi didistilasi sederhana, maka nanti akan terbentuk kristal yang tidak dapat terdistilasi pada dinding labu distilasi. Kristal kafein dikeruk, diambil sebagian untuk dihitung titik lelehnya dengan alat melting-block. Kemudian diambil sebagian untuk dilakukan kromatografi lapis tipis, dan uji alkaloid.

Isolasi Pada Jambu Keling

Endapan dikeringkan dan diektraksi dan direndam dalam khloroform dan dipekatkan dengan alat rotary evaporator.

Ekstrak pekat khloroform (2 g) dikhromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 sebanyak 60 gram dengan fasa gerak khloroform: metanol dengan menaikkan kepolaran bertingkat. Fraksi yang keluar kolom khromatografi ditampung menggunakan vial serta dimonitor dengan khromatografi lapis tipis. Fraksi dengan Rf yang sama dan positip dengan pereaksi Maeyer yang ditandai dengan munculnya warna putih, digabung selanjutnya, diuapkan pelarutnya kemudian fraksi ini direkristalisasi untuk memperoleh kristal murni.

4.      Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contoh 

Jawaban :

Bahan alam yang beraneka ragam, pada umumnya dikelompokkan berdasarkan kesamaan strukturnya atau jalur biosintesisnya. Mengelusidasi mekanisme produksi senyawa dalam organisme asalnya. Ini adalah bidang yang rumit tetapi sangat menarik. Sangat penting dan erat kaitannya dengan sintesis bahan alam karena trendsintesis sekarang yang biomimetics (artinya meniru alam). Biosintesis merupakan pembentukkan molekul alami yang terjadi di dalam sel dari molekul lain yang kurang rumit strukturnya, melalui reaksi endeorganik. Sedangkan jalur biosintetis dapat diartikan sebagai urutan atau proses yang di dalamnya terdiri atas tahap-tahap pembentukkan dari senyawa yang sederhana menjadi senyawa kompleks. Proses biosintesis akan berlangsung sangat kompleks, tergantung dari macam enzim yang tersedia sehingga tumbuhan sejenis yang tumbuh di daerah yang berbeda sangat memungkinkan untuk mempunyai jalur pembentukkan metabolit tertentu yang tidak identik   Setelah Jalur Pengetahuan akan jalur biosintesis ini memungkinkan untuk melakukan modifikasi dari jalur tersebut sehingga dapat diproduksi, mengetahui struktur metabolit yang dihasilkan, kemudian dapat dilakukan sintesis untuk menghasilkan derivatnya. Pada dasarnya isolasi senyawa kimia dari bahan alam itu adalah sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senayawa tunggal yang murni. Metode isolasi yang tepat tidak akan merusak struktur senyawa yg ingin diisolasi, sehingga pada saat penentuan struktur dapat diketahui dengan jelas struktur senyawa tersebut, hasil isolasi di analisis dengan kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom atau PTLC, kemudian diperiksa dengan spektoskopi (IR, UV-VIS dan NMR), HPLC dan di analisis ikatan-ikatan yang muncul pada daerah serapan berdasarkan spektoskopinya dan diperoleh struktur. Contohnya :

Isolasi
Kulit buah anggur yang telah dihancurkan dicampur dengan asam klorida 1% dalam metanol p.a 250 ml sambil diaduk-aduk. Ekstrak kasar tersebut dibiarkan selama 60 menit atau sampai warnanya memucat. Setelah itu disaring dengan corong buchner menggunakan kertas Whatman no. 1. Filtrat hasil penyaringan disentrifuse ± 10 menit. Kemudian filtrat tersebut dipekatkan dengan rotary evaporator vakum pada suhu 60°C sampai volumenya tinggal 1/10 dari volume awal sebelum dipekatkan. Perlakuan yang sama dilakukan dengan menggunakan pelarut asam klorida 1% dalam pelarut etanol 95% dan pelaqrut asam klorida 1% dalam air masing-masing sebanyak 250 ml. Untuk Etanol 95% pada suhu 70°C, dan air 90°C

Pemisahan Senyawa Flavonoid dengan KLT Preparatif

Pada KLT preparatif eluen yang digunakan adalah eluen terbaik hasil KLT analitik yaitu etil asetat- asam asetat glasial- asam format- air (20: 2,2: 2,2 :5,2). Plat yang digunakan pada KLT preparatif adalah plat KLT silika gel 60 F254 dengan ukuran yang lebih besar yaitu 10x20 cm. Noda yang dihasilkan pada KLT preparatif juga menghasilkan 3 noda hanya saja pada saat disinari lampu UV noda yang dihasilkan terlihat menyala di panjang gelombang 366 nm. Rf.

Pada penelitian ini, dugaan sementara senyawa antosianin hasil kromatografi lapis tipis, didasarkan pada nilai Rf dan kenampakan warna noda yang merujuk pada penelitian Wagner dan Bladt (2001) tentang identifikasi senyawa antosianin dari Malvae silvestris flos dan Cyani flos dengan metode pemisahan KLT dan menggunakan eluen etil asetat-asam asetat glasial-asam format-air (100:11:11:26) dan n-Butanol-asam asetat glasial-air (50:10:20). Harga Rf berkisar 0,05-0,1 pada area merah (Wagner and Bladt, 2001). Sedangkan noda-noda yang dihasilkan pada masing-masing panjang gelombang dikerok dan dilarutkan dalam pelarut metanol untuk diidentifikasi menggunakan spektrofotometri FTIR dan UV-Vis.

Identifikasi Antosianin dengan Spektrofotometer UV-Vis dan Spektrofotometer FTIR

Data kromatogram yang dihasilkan memberikan dugaan sementara senyawa antosianin yang ada pada masing-masing noda. Untuk lebih jelas maka diperlukan identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis dan spektrofotometer FTIR. Selanjutnya dari ketiga noda yang dihasilkan dari KLT Preparatif, dikerok dan masing-masing diekstrak dengan metanol, disentrifus, kemudian supernatannya diambil untuk analisis spektrofotometer. Dalam molekul yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi, elektron π dapat mengalami delokalisasi atau perpindahan tempat di dalam molekul. Pengaruh delokalisasi tersebut akan menurunkan energi orbital π*. Lebih rendahnya selisih energi antara orbital π dan π* pada sistem terkonjugasi ini mengakibatkan penyerapan sinar UV-Vis terjadi pada panjang gelombang yang lebih panjang dari yang dialami sistem tak terkonjugasi. Makin banyak ikatan rangkap terkonjugasi, makin kecil energi yang diperlukan untuk mengalami transisi, sehingga absorbsi akan semakin bergeser ke panjang gelombang yang lebih besar.

Spektra antosianin dalam UV-Vis dengan penambahan pereaksi geser (Isolat 1). Karakteristik spektra antosianin memberi informasi penting dari aglikon dan tipe glikosilasi. Spektrum antosianin khas diukur dengan metanol HCl 0,01%. Tipe aglikonnya bisa diduga dari panjang gelombang maksimum. Pada isolat 1 ini diperoleh panjang gelombang 500,8 nm. Pelargonidin 3-monoglukosida panjang gelombang maksimumnya pada 505 nm (Harborne, 1967). Dari spektra di atas dapat diketahui bahwa Metanol-HCl tidak menyebabkan pergeseran yang menunjukkan kemungkinan senyawa mengandung jenis antosianin Pelargonidin 3-monoglukosida. Sedangkan penambahan AlCl3 menyebabkan pergeseran

sebesar 7 nm atau bergeser ke arah yang lebih besar. Pergeseran ini tidak mempengaruhi adanya gugus ortodihidroksi dikarenakan dalam penelitian Belitz dan Grosch (1999) jika panjang gelombang ditambahkan aluminium klorida bergeser sebesar 14-23 nm. Sedangkan dalam penelitian Markham (1988) jika ditambahi pereaksi geser aluminium klorida panjang gelombang bergeser 25-35 nm ke arah yang lebih besar. Senyawa antosianin jenis pelargonidin 3- monoglukosida jika ditambahi pereaksi geser aluminium klorida tidak mengalami geser batokromik.

Pada spektra antosianin isolat 1 dalam FTIR tertera dalam gambar berikut

ini:

Gambar 4.4: Spektra antosianin dalam FTIR (Isolat 1)

Pada spektrum FTIR menunjukkan bahwa isolat 1 kemungkinan mengandung beberapa gugus fungsi seperti –OH yang ditunjukkan oleh serapan tajam pada daerah 3431,13 cm-1 yang didukung juga oleh munculnya serapan pada bilangan gelombang 1055,95 cm-1 untuk ikatan –C-O alkohol. Serapan ikatan rangkap –C=C aromatik ditunjukkan oleh serapan tajam pada bilangan gelombang 1633,59 cm-1 yang didukung juga oleh munculnya serapan pada

bilangan gelombang 1473,51 cm-1.

Berdasarkan hasil kromatogram serta spectrum UV-Vis dan spectrum FTIR disimpulkan bahwa struktur senyawa antosianin yang diduga untuk isolat 1

adalah sebagai berikut:

ISOLASI ANTOSIANIN

Antosianin adalah metabolit sekunder dari famili flavonoid, dalam jumlah besar ditemukan dalam buah-buahan dan sayur-sayuran Antosianin adalah suatu kelas dari senyawa flavonoid, yang secara luas terbagi dalam polifenol tumbuhan. Flavonol, flavan-3-ol, flavon, flavanon, dan flavanonol adalah kelas tambahan flavonoid yang berbeda dalam oksidasi dari antosianin. Larutan pada senyawa flavonoid adalah tak berwarna atau kuning pucat. Antosianin adalah senyawa flavonoid dan merupakan glikosida dari antosianidin yang terdiri dari 2-phenyl benzopyrilium (Flavium) tersubstitusi, memiliki sejumlah gugus hidroksil bebas dan gugus hidroksil termetilasi yang berada pada posisi atom karbon yang berbeda. Seluruh senyawa antosianin merupakan senyawa turunan dari kation flavilium, dua puluh jenis senyawa telah ditemukan. Tetapi hanya enam yang memegang peranan penting dalam bahan pangan yaitu pelargonidin, sianidin, delfinidin, peonidin, petunidin, dan malvidin.

EKSTRAKSI PIGMEN ANTOSIANIN BUAH PAPRIKA

Timbang buah paprika sebanyak 50 gr. Buat larutan asam tartarat 0.1% dengan volume 500 ml sebagai larutan pengekstrak (akuades + asam tartarat = 4:1). Buah paprika dan larutan pengekstrak sebanyak 150 ml dihancurkan dalam blender. Hancuran buah dipindahkan ke dalam gelas kimia dan sisa larutan pengekstrak (350 ml) ditambahkan ke dalam hancuran buah. Ekstraksi secara maserasi yaitu mengaduk campuran buah dan pelarut tersebut dengan pengaduk magnetic pada suhu ruang selama 24 jam. Hasil yang diperoleh disentrifugasi lalu supernatannya disaring dengan penyaring vakum. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga diperoleh ekstrak pekat yang siap dianalisis.

Penentuan Kolesterol Total Serum Darah

Kolesterol termasuk senyawa steroida dengan rumus C₂₇H₄₅OH. Kolesterol merupakan senyawa yang memiliki inti empat cincin siklopentano – fenantren. Termasuk lemak dengan daya larut yang sangat kecil dalam air. Kadarnya dalam plasma darah 150-200mg/ml, sekitar 2x kadar glukosa darah. Dalam plasma darah 30% berikatan dengan lipoprotein yang mampu menambah daya larutnya dalam darah. Sebanyak 70% lagi kolesterol darah berada berupa kolesterol ester. Kolesterol juga banyak terdapat dalam empedu, dengan kadar 390mg/100ml (Yatim, 2003)

Darah atau serum darah diekstraksi dengan campuran alkohol-aseton yang

bertujuan memindahkan kolesterol dan lipida-lipida lain serta mengendapkan protein.

Kemudian pelarut organik dievaporasi pada penangas air (waterbath). Residu keringnya kemudian dilarutkan dalam kloroform. Campuran kloroform kemudian ditentukan secara klorimetri menggunakan reagen Lieberman-Burchard. Kolesterol serum darah secara normal berkisar dari 100 – 250 mg/100 ml. Rata-rata jumlah kolesterol dalam serum darah adalah 200 mg/100 ml, pada usia 25 tahun yang lebih lanjut meningkat secara perlahan dengan meningkatnya usia sampai usia 40 – 50 tahun.

Prosedur Kerja

Masukkan 10 ml pelarut aseton-alkohol dalam tabung sentrifuga, kemudian

tambahkan 0,2 ml serum atau darah. Celupkan tabung dalam penangas air mendidih yang

bergoyang (boiling waterbath), sampai larutan mulai mendidih. Pindahkan tabung dan

teruskan pengadukan campuran selama 5 menit. Dinginkan sampai mencapai temperatur

kamar, kemudian disentrifuga. Dekantasi supernatannya ke dalam tabung reaksi, dan

uapkan pada waterbath mendidih sampai kering. Dinginkan dan larutkan residunya dalam

2 ml kloroform. Pada saat yang sama buat larutan kolesterol standar dan blanko dalam 2 ml

kloroform. Tambahkan 3 ml campuran anhidrida asam asetat dan asam sulfat pekat pada

semua tabung Tempatkan semua tabung pada tempat gelap dan suhu kamar, kemudian

baca absorbansinya pada panjang gelombang 686 nm [hasil dari penentuan panjang

gelombang (λ) maksimum].